Năm 1803 ông được bổ nhiệm làm trợ lý thư viện của Viện Bologna, và ngay sau đó đã được phục chức giáo sư ngôn ngữ phương Đông và Hy Lạp. Chức vụ giáo sư các ngôn ngữ phương Đông đã bị các phó vương cất chức vào năm 1808, nhưng một lần nữa phục hồi khi Giáo hoàng Piô VII khôi phục lại năm 1814. Mezzofanti giữ chức vụ này cho đến khi ông rời Bologna để đi đến Roma vào năm 1831 làm thành viên của Tu Hội Truyền bá Đức tin (Congregatio de Propaganda Fide), cơ quan chủ quản các Giáo hội Công giáo cho các hoạt động truyền giáo. Năm 1833, ông đã kế tục Angelo Mai làm trưởng giám sát của Thư viện Vatican, và vào năm 1838 đã được sắc phong hồng y của Thánh Onofrio al Gianicolo và giám đốc nghiên cứu tại Thánh Bộ Truyền bá đức tin. Các công việc khác của ông bao gồm dân tộc học, khảo cổ học, huy chương, và thiên văn học[1].